2024-09-07
細(xì)胞外囊泡（Extracellular Vesicle， EV）在醫(yī)藥研究中有非常好的應(yīng)用前景。但如果EV保存條件不當(dāng)致使其濃度降低，往往也意味著EV活性降低，生物完整性缺失，最終會(huì)嚴(yán)重影響EV的應(yīng)用。所以，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，如何穩(wěn)定地保存EV，如何對(duì)已保存的EV進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，也是一項(xiàng)非常重要的工作。
ZetaView是在EV表征中經(jīng)常用到的一種經(jīng)典的NTA技術(shù)手段。它可以通過(guò)實(shí)時(shí)追蹤顆粒運(yùn)動(dòng)的方式，檢測(cè)EV的粒徑分布、數(shù)量濃度、zeta電位等信息，還可以借助熒光標(biāo)記的方式，鑒定樣品的純度和生物標(biāo)志物，對(duì)EV樣品進(jìn)行Colocalization分析。因此， ZetaView被廣泛應(yīng)用于EV的表征與鑒定工作中。
今天的文章以某種EV為例，介紹了如何通過(guò)ZetaView的熒光檢測(cè)功能（F-NTA），對(duì)所保存的EV樣品進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。該EV樣品來(lái)源于HEK293T，能表達(dá)熒光蛋白CD63 dTomato，同時(shí)又通過(guò)CD63 APC和CD81 BV421對(duì)其進(jìn)行熒光標(biāo)記。該樣品從-80℃條件解凍后，在25℃下保存0天、3天、6天、10天，再分別通過(guò)散射光模式和熒光模式對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。
ZetaView檢測(cè)結(jié)果顯示（如圖1），在散射光模式、CD63-APC熒光模式、dTomato熒光模式下檢測(cè)到的EV濃度，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯降低，說(shuō)明隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，EV樣品在不斷降解，導(dǎo)致濃度在不斷降低。這三種測(cè)試模式下得到的結(jié)果是一致的。CD63-APC熒光模式和dTomato熒光模式下，在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)到的EV濃度基本一致，且均低于相同時(shí)間的散射光模式下測(cè)到的EV濃度。兩種熒光模式下得到的數(shù)據(jù)可以相互佐證，也進(jìn)一步證明了以上測(cè)試方法的可靠性。有意思的是，CD81-BV421熒光模式下測(cè)到的EV濃度變化不大，可能與對(duì)應(yīng)的EV亞群在該保存條件下穩(wěn)定性很好有關(guān)。
圖1. 通過(guò)ZetaView在散射光模式、CD63-APC熒光模式、CD81-BV421熒光模式、dTomato熒光模式下，分別于第0、3、6、10天測(cè)到的EV濃度
另外，如圖2所示，在同一測(cè)試模式中、不同保存時(shí)間下，ZetaView測(cè)到的EV粒徑值比較穩(wěn)定，說(shuō)明EV濃度降低的原因是降解，而不是聚集。不同測(cè)試模式下，ZetaView測(cè)到的粒徑值有一定的差異，這與所檢測(cè)的EV群體差異有關(guān)。
圖2. 通過(guò)ZetaView在散射光模式、CD63-APC熒光模式、CD81-BV421熒光模式、dTomato熒光模式下，分別于第0、3、6、10天測(cè)到的EV粒徑
由以上的ZetaView測(cè)試數(shù)據(jù)可以看出，在特定的保存條件下，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，該EV樣品在不斷地降解。該數(shù)據(jù)從另一方面也證實(shí)了ZetaView熒光檢測(cè)方法（F-NTA）用于EV質(zhì)量的快速評(píng)估的可行性。
盡管以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繁多，但在ZetaView上，單次進(jìn)樣即可完成以上所有數(shù)據(jù)的測(cè)試，實(shí)際上，實(shí)驗(yàn)人員還可以進(jìn)一步對(duì)該EV樣品進(jìn)行多熒光標(biāo)記的Colocalization檢測(cè)和zeta電位檢測(cè)。這也使得ZetaView的強(qiáng)大功能在EV表征與鑒定工作中得到更多的體現(xiàn)。
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